DLS+SEC+DSC多種技術(shù)結(jié)合，助力AAV基因遞送載體的表征

DLS可用于樣品關(guān)鍵生物物理參數(shù)的測(cè)量，或用于篩分優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定的的樣品和那些受污染、有聚體的樣品。通過(guò)Zetasizer Ultra納米分析儀的多角度動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)（MADLS），不僅可以在幾分鐘內(nèi)測(cè)量樣品的流體動(dòng)力學(xué)直徑和粒徑分布（包括聚集體），還可以測(cè)量每個(gè)群體的顆粒濃度。此外，儀器新的自適應(yīng)相關(guān)算法提高了測(cè)量精度、重現(xiàn)性，以及對(duì)異物或大的聚集體的包容度。

圖1. Zetasizer Ultra納米粒度儀和DLS測(cè)量粒徑分布的案例

使用MADLS技術(shù)

進(jìn)行AAV載體大小和濃度測(cè)量

本文用Zetasizer Ultra分析了3個(gè)AAV樣品。濃度結(jié)果與基于衣殼ELISA的病毒滴度測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

采用多角度動(dòng)態(tài)光散射（MADLS）技術(shù)測(cè)量3個(gè)AAV樣品的顆粒大小分布，重復(fù)測(cè)量3次，結(jié)果如下。顯示有少量樣品團(tuán)聚。標(biāo)準(zhǔn)品（A）發(fā)生的團(tuán)聚比AAV樣品（B和C）更多一些。同時(shí)分別測(cè)得了AAV單體和團(tuán)聚體的顆粒濃度，結(jié)果見(jiàn)圖D-F。表1中對(duì)比了MADLS方法和衣殼ELISA法測(cè)得的濃度結(jié)果。AAV樣品的RSD<15%，ATCC AAV2參考標(biāo)準(zhǔn)品的RSD 45%。

圖2. 顆粒大小分布的3次重復(fù)測(cè)量結(jié)果：圖A-ATCC AAV2標(biāo)品，圖B-AAV樣品1，圖C-AAV樣品2。圖D-F的顆粒濃度結(jié)果一一對(duì)應(yīng)圖A-C中的樣品。

采用AAV衣殼ELISA方法進(jìn)行測(cè)量

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA) 是病毒滴度或衣殼濃度的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量方法。我們將MADLS濃度數(shù)據(jù)與已有的衣殼ELISA方法測(cè)量的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。單分散rAAV樣品（RSD 13-15%）與ELISA方法測(cè)量的rAAV衣殼滴度幾乎沒(méi)有差異。

這些結(jié)果表明了完整 rAAV 衣殼的無(wú)標(biāo)記分析方法與其他常見(jiàn)滴度測(cè)定方法是互補(bǔ)的。發(fā)生團(tuán)聚的多分散rAAV樣品的RSD高達(dá)45%。我們認(rèn)為這是因?yàn)槎喾稚悠返某叽缇容^低。

表1. 衣殼ELISA測(cè)得的濃度數(shù)據(jù)和MADLS測(cè)定的顆粒濃度數(shù)據(jù)，3個(gè)樣品分別是ATCC AAV2參考標(biāo)準(zhǔn)品，樣品1，樣品2。濃度數(shù)據(jù)單位是顆粒數(shù)量/ml。n表示3次重復(fù)測(cè)量中觀察到該峰的次數(shù)。n/a表示未觀察到該峰。

多檢測(cè)器尺寸排阻色譜（SEC）可用于多種rAAV屬性的測(cè)量，如衣殼滴度、絕對(duì)分子量、聚集體、寡聚體、片段分布和空殼率。

市售rAAV5樣品（Virovek，US）含有空衣殼和完整衣殼的混合物。完整衣殼rAAV樣品Mw是4.49x10⁶ g/mol，蛋白質(zhì)含量86%，ssDNA Mw 6.13x10⁵ g/mol，完整衣殼AAV占比78.1%，總滴度7.48x10¹³（單體和聚集體）?？誶AAVs Mw小一些，3.84x10⁶ g/mol，總滴度5.91x10¹³（單體和聚集體）。當(dāng)空衣殼和完整衣殼以已知比例添加時(shí)，測(cè)得的空殼率與預(yù)測(cè)結(jié)果高度相關(guān)，R²高達(dá)0.99。

圖3. OMNISEC系統(tǒng)和示例色譜譜。示例中樣品為空rAAV單體、二聚體、高聚體和片段的混合物。針對(duì)單體峰進(jìn)行空殼率分析。

圖4. OMNISEC空殼率分析結(jié)果。預(yù)估值（表格第三列）來(lái)自添加的空衣殼和完整衣殼比率，調(diào)整到100%?；贛w得到完整衣殼占比 78.1%。計(jì)算值（表格第四列）基于單體峰的Mw值得到。

差示掃描量熱儀（DSC）可用于測(cè)量蛋白質(zhì)、核酸和病毒衣殼的熱變性和熱穩(wěn)定性。該技術(shù)測(cè)量溶液中分子熱誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)變化的焓變（ΔH）和結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變溫度（T_m）。該測(cè)量方式直接、溶液相和非標(biāo)記，不需要額外的熒光標(biāo)記或抗體捕獲。

空衣殼和完整衣殼rAAV5樣品（Virovek, US）的PEAQ-DSC結(jié)果顯示有多個(gè)轉(zhuǎn)變溫度（T_m），與衣殼分解（T_m1）和ssDNA熔融（T_m2）有關(guān)。此外，完整rAAVs在50度時(shí)顯示出弱的熱特征，而空殼rAAVs沒(méi)有，這表示熱誘導(dǎo)事件的發(fā)生可能與衣殼脫殼相關(guān)的完整rAAVs里的結(jié)構(gòu)重組有關(guān)。

圖5. MicroCal PEAQ-DSC自動(dòng)系統(tǒng)和完整rAAV的DSC熱圖譜示例。圖譜顯示了明顯的熱轉(zhuǎn)變溫度（T_m）分別是89°和94°。紅星號(hào)標(biāo)注出早期的熱轉(zhuǎn)變發(fā)生在50°。